2021年6月18日，中華人民共和國(guó)海關(guān)總署發(fā)布了2021年第45號(hào)公告。關(guān)于《進(jìn)口再生鋼鐵原料檢驗(yàn)規(guī)程》等76項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，其中《國(guó)境口岸恙蟲(chóng)病東方體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》SN/T 5332-2021自2022年1月1日起實(shí)施，本文對(duì)該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解讀。

海關(guān)總署公告2021年第45號(hào)及附件

一、恙蟲(chóng)病是什么

恙蟲(chóng)病由恙蟲(chóng)病東方體引起，以鼠類(lèi)為主要傳染源的自然疫源性疾病。臨床上以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疹為特征。我國(guó)古代稱(chēng)恙蟲(chóng)病為沙虱熱，廣東稱(chēng)為元寶瘡、爪子瘡，福建平潭稱(chēng)三陽(yáng)病，浙江永嘉稱(chēng)楊梅病、六月客等。

自我國(guó)廣東省報(bào)告首例恙蟲(chóng)病病例以來(lái)，恙蟲(chóng)病疫區(qū)已由海南、廣東、福建、浙江等省區(qū)擴(kuò)展到山東、江蘇、山西、黑龍江、吉林、遼寧以及天津等省市。2006年報(bào)告恙蟲(chóng)病病例數(shù)1244例；2007年報(bào)告1332例、死亡1例；2008年報(bào)告2592例、死亡3例，恙蟲(chóng)病流行呈上升趨勢(shì)。研究表明，已有10屬21種鼠類(lèi)自然感染恙蟲(chóng)病東方體，恙蟲(chóng)病已經(jīng)成為我國(guó)重要的鼠源性自然疫源性疾病，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成極大威脅。

二、檢測(cè)對(duì)象是什么

本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)象包括國(guó)境口岸及出入境交通工具、集裝箱、貨物、行李等場(chǎng)所采集的鼠類(lèi)樣品，國(guó)境口岸疑似恙蟲(chóng)病患者的臨床樣品。

鼠類(lèi)是出入境交通工具中常見(jiàn)的病媒生物之一，可隨飛機(jī)、輪船等載體在國(guó)境口岸之間擴(kuò)散。歷史上多次發(fā)生由于鼠類(lèi)入境造成疫病暴發(fā)流行的事例。1898年，一艘汽船將染有鼠疫耶爾森菌的褐家鼠（Rattus norvegicus）從印度帶到了馬達(dá)加斯加島，褐家鼠在該島大量繁殖，使當(dāng)?shù)厥笠哳l繁發(fā)生。近年來(lái)，我國(guó)衛(wèi)生檢疫機(jī)構(gòu)在北京、上海、寧波、成都等口岸的入境飛機(jī)、輪船、集裝箱中查獲大量的鼠類(lèi)。

鼠類(lèi)的輸入對(duì)我國(guó)國(guó)境口岸的衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，國(guó)境口岸是防范病媒生物輸入的第一道防線。加強(qiáng)對(duì)出入境交通工具及集裝箱、貨物等的排查和對(duì)輸入性鼠類(lèi)攜帶病原體的監(jiān)測(cè)檢測(cè)，是有效防止傳染病通過(guò)口岸輸入、輸出，避免疫情大范圍暴發(fā)的基礎(chǔ)和前提，也是國(guó)境口岸檢疫執(zhí)法和疾病監(jiān)測(cè)的迫切需要。

三、本標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)方法

本標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。參考恙蟲(chóng)病東方體Karp、Gilliam、Kato血清型56-kDa蛋白基因序列，設(shè)計(jì)并合成上下游引物及Taqman-MGB探針，擴(kuò)增片段大小為130 bp。

以Karp型基因序列（GI:63079111）為例，對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)域核酸序列分別向兩側(cè)外延，構(gòu)建質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。適當(dāng)稀釋?zhuān)��?dāng)檢測(cè)Ct值在20~35之間，進(jìn)行分裝備用。

序列如下：

GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。

四、標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)條件及系統(tǒng)評(píng)價(jià)情況

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

以LightCycler 480I 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器為例，反應(yīng)條件如下：

50 ℃ 2分鐘；95 ℃ 10分鐘；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1分鐘，循環(huán)45次，退火時(shí)收集熒光信號(hào)。熒光通道為FAM。由于不同實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀性能有差異，可根據(jù)實(shí)際儀器型號(hào)，對(duì)檢測(cè)程序略作調(diào)整。

1

敏感性及線性評(píng)價(jià)情況

本標(biāo)準(zhǔn)提供的恙蟲(chóng)病東方體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，定量關(guān)系曲線線性擬合系數(shù)R?=0.9988，檢測(cè)敏感性為54.5個(gè)拷貝。

敏感性擴(kuò)增曲線圖

定量關(guān)系曲線

2

特異性及重復(fù)性評(píng)價(jià)

本標(biāo)準(zhǔn)提供檢測(cè)方法與莫氏立克次體（R.mooseri）、普氏立克次體(R.prowazekii)、立氏立克次體（R.brasiliensis）、Q熱立克次體（C.burnetii）、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（A.phagocytophi）及伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi）無(wú)交叉反應(yīng)。批內(nèi)及批間重復(fù)性變異系數(shù)均小于5%。

特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

五、結(jié)果判讀

1

質(zhì)量控制

有效實(shí)驗(yàn)應(yīng)同時(shí)滿足如下條件：

—— 陽(yáng)性對(duì)照有擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35；

—— 陰性對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)Ct值，或Ct值≥40，且無(wú)擴(kuò)增曲線。

2

陰性結(jié)果

在有效實(shí)驗(yàn)條件下，待檢樣品Ct值≥40，且無(wú)典型擴(kuò)增曲線，判為陰性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陰性（實(shí)時(shí)熒光PCR法）。

3

陽(yáng)性結(jié)果

在有效實(shí)驗(yàn)條件下，陽(yáng)性結(jié)果判斷及報(bào)告如下：

—— 待檢樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陽(yáng)性（實(shí)時(shí)熒光PCR法）；

—— 如待檢樣品35＜Ct值≤40，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，需要復(fù)檢，復(fù)檢后Ct值仍在35~40之間，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陽(yáng)性（實(shí)時(shí)熒光PCR法）。否則判為陰性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陰性（實(shí)時(shí)熒光PCR法）；

—— 如待檢樣品40＜Ct值≤45，且出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，建議采用濃縮方式處理核酸樣品后復(fù)檢，復(fù)檢后Ct值有明顯減小趨勢(shì)，且擴(kuò)增曲線有典型對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，判為陽(yáng)性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陽(yáng)性（實(shí)時(shí)熒光PCR法），此類(lèi)樣品建議采用其他檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。否則判為陰性，報(bào)告為待檢樣品恙蟲(chóng)病東方體核酸陰性（實(shí)時(shí)熒光PCR法）。

六、生物安全及防污染要求

生物安全應(yīng)遵循GB 19489和WS 233 中相關(guān)規(guī)定，本方法中恙蟲(chóng)病東方體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)應(yīng)在生物安全2級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行；PCR防污染要求應(yīng)遵循WS/T 230中相關(guān)規(guī)定。